新型冠状病毒肺炎实验室诊断

作者：李红鹏 闫雅茹 张柳 李诗琪 李庆云

通信作者：李庆云

Email：liqingyun68@hotmail.com

摘要

新型冠状病毒肺炎(COVID-19)正在全球范围内流行，已造成大量死亡，严重威胁公共卫生安全。作为一种全新的高传染性疾病，对其认识需不断探索与完善。目前尚无特效药物，疫情管控依赖于早期准确的诊断与严格的隔离措施。因此，实验室检测方法的优化及准确性成为疫情防控极大的挑战。《新型冠状病毒肺炎诊疗方案(试行第八版)》规定，病毒核酸检测阳性、病毒基因测序，与已知的新型冠状病毒高度同源或者血清学特异性抗体检测阳性作为实验室确诊依据。本文总结分析现有实验室检测方法的优缺点和意义，同时展望检测技术未来的发展方向，以期为优化COVID-19实验室诊断提供参考。

目前，全球新型冠状病毒肺炎(COVID-19)疫情防控形势仍相当严峻，其病原体严重急性呼吸综合征冠状病毒2(severe acute respiratory syndrome coronavirus 2，SARS-CoV-2)为β属冠状病毒的Sarbecovirus亚属，基因与蝙蝠来源的冠状病毒bat-SL-CoVZC45和bat-SL-covzcx21有88%同源性，与严重急性呼吸综合征冠状病毒(severe acute respiratory syndrome coronavirus，SARS-CoV)基因同源性约79%，但与中东呼吸系统综合征冠状病毒(Middle East respiratory syndrome coronavirus，MERS-CoV)同源性仅为50%[1,2,3]，边缘有形似日冕的突起，呈圆形、椭圆形等多形性，直径60～140 nm[4]。SARS-CoV-2具有较强的传染性，尚无针对病毒的特效药物，因此，早期准确的诊断与隔离是疫情管控的关键。目前实验室病原学诊断主要包括呼吸道或者血液标本实时荧光RT-PCR的病毒核酸检测、病毒基因测序，以及病毒抗体检测。本文总结3种检测方法特点和临床意义，并介绍高通量微流控技术在COVID-19疫情防控中的应用，以期为优化COVID-19实验室诊断和疫情防控提供参考。

1 核酸与抗体检测

1.1 核酸检测

SARS-CoV-2核酸是病毒感染后能最早检测到的标志物，对早诊断、早治疗和疫情防控具有重大意义[5]。

1.1.1 RT-PCR核酸检测

RT-PCR核酸检测是诊断SARS-CoV和MERS-CoV重要的手段，具有较高的特异度和敏感度[6,7]，亦是此次诊断COVID-19最常用的实验室检测方法。实时荧光RT-PCR通过荧光染料或荧光探针实时监测PCR扩增过程，与普通PCR相比，实现了PCR从定性到定量的飞跃，且通过荧光信号检测代替普通电泳，极大地提高了检测敏感度和特异度[8]。SARS-CoV-2基因组包括开放读码框1a/b(open reading frame 1ab，ORF1ab)、核衣壳编码基因(nucleocapsid protein，N)、刺突编码基因(spike protein，S)、膜蛋白编码基因(membrane protein，M)和包膜蛋白编码基因(envelope protein，E)[9]。检测试剂盒基于SARS-CoV-2基因组进行选择性扩增，不同试剂盒的检测原理基本一致，但因其引物、探针设计存在不同，有单靶区段(ORF1ab)、双靶区段(ORF1ab、N或E)、三靶区段(ORF1ab、N和E)的检测和判读差别。比对分析研究发现，ORF1ab片段和N基因序列是高度保守基因区域[10]。Corman等[11]利用ORF1ab和E基因为靶标对来自不同中心的500余份临床标本进行检测，均未出现假阳性结果，仅4例标本起初测定为弱阳性，复测为阴性，显示高度敏感性；研究亦发现ORF1ab片段和N基因与其他310份呼吸道病毒和细菌标本之间基本无交叉反应，提示检测的高度特异性。因此，当前核酸检测主要针对ORF1ab和N编码序列，同一份标本中ORF1ab和N编码序列同时阳性可即可确诊，若单个靶标阳性，则需重新采样检测。判别阳性标准：Ct值<37；阴性标准：无Ct值或Ct值>40；可疑：Ct值37～40，建议重复实验，若重做结果Ct值<40，扩增曲线有明显起峰，亦判断为阳性，否则为阴性。

荧光RT-PCR技术检测存在假阳性和假阴性问题[12]。假阳性缘于标本间交叉污染或实验室扩增产物的遗留污染，在目前严格执行"三个阴性样本随机放在临床样本中间同时参与检测全过程"的质控策略下，可有效解决。但是，RT-PCR核酸检测阴性不能完全排除病毒感染的可能性。在此次疫情救治过程中出现不少假阴性病例，即出现临床表现和CT影像提示为COVID-19，病情也在不断发展，但核酸检测结果为阴性，后续检测又为阳性。假阴性原因主要涉及样本采集的部位、时机、方法以及体外诊断试剂盒等因素。

采集的部位与方法对检测结果存在影响。上呼吸道是病毒样本采集最常用的部位，包括鼻咽拭子、口咽拭子和鼻咽灌洗。Lieberman等[13]比较3种方法在诊断呼吸道流感病毒、冠状病毒和鼻病毒监测中的敏感度，发现鼻咽拭子取材检测敏感度高于口咽拭子，鼻咽灌洗取材敏感度最高；刘焱斌等[14]在对100例COVID-19患者研究中发现鼻拭子比口咽拭子有更高的检测阳性率；de la Tabla等[15]研究提示鼻咽-口咽拭子联合取材对甲型流感的检测准确性优于鼻咽灌洗取材，可提高PCR核酸检测的阳性率。痰液和其他下呼吸道分泌物可能具有更高的病毒载荷，病例报道研究显示3%高渗盐雾化诱导排痰成功诊断咽拭子、鼻拭子多次采样检测阴性患者[16]；组织活检和尸体解剖结果均显示患者的SARS-CoV-2主要感染部位在人体下呼吸道及肺部[17,18]。

采集时机对PCR核酸阳性检出率有影响。Thevarajan等[19]报道1例普通型COVID-19患者出现症状后4 d鼻咽拭子PCR检测病毒阳性，而发病后7 d PCR病毒检测为阴性；Young等[20]研究显示在病情发展过程中存在鼻咽拭子PCR核酸检测阳性和阴性交替现象，可能原因为SARS-CoV-2感染上气道细胞后，在机体免疫的作用下取材部位病毒载荷存在波动；Pan等[21]报道，患者在出现症状后约4～6 d，咽拭子和痰液样本中的病毒载量达到峰值，后3～4 d持续转阴，而部分患者痰液样本中病毒载量3～5 d达到峰值，之后出现病毒载量明显波动，检测阳性与阴性交替现象，亦提示间歇排毒现象和病毒载量在不同采样时机的个体差异。

因此，当核酸检测阴性，但临床高度怀疑为感染患者时，应通过多次与多部位采样以降低假阴性率[22]，此外，因疫情需要，已有大量核酸检测试剂盒投入市场，但质量参差不齐，对于怀疑假阴性的患者可合并采用2种及以上不同厂家的试剂进行检测和验证，以提高诊断准确性。同时样本的采集、保存、运输、处理过程需严格遵守我国《新型冠状病毒感染的肺炎实验室检测技术指南》。最后，对于PCR多次检测阴性的高度疑似患者亦可进行病毒基因测序和病毒抗体检测，以提高检测的阳性率。

1.1.2 病毒基因测序

基于二代测序技术的病原体宏基因组测序是目前临床上最常用的测序方法，通过对临床样本中直接提取的DNA和/或RNA进行高通量测序，再经过数据库比对与生物信息学分析，可一次性完成细菌、真菌、病毒和寄生虫等多种病原体检测，并提供进一步病毒演变分析数据支持，能够鉴别包括SARS-CoV-2在内的冠状病毒和其他呼吸道病原体感染，实现病毒序列快速检测[23,24]。本次COVID-19疫情暴发之初，我国研究团队通过二代测序技术迅速对SARS-CoV-2基因组进行鉴定分析，为疾病的诊断与疫情防控赢得宝贵时间[25]。测序技术亦可用于包括SARS-CoV-2在内的多种呼吸道病毒的鉴别诊断和检测病毒突变[26,27]。与荧光RT-PCR检测技术比较，二代测序技术检测操作复杂，检测周期长，模型构建数据分析难度大及经济成本较高等问题限制了其在疫情防控中的广泛使用[28,29]；但二代测序策略在追踪传染源和了解传染源的演变，调查疫情的传播和传播链，促进有效和快速的分子诊断技术的研发，寻找有效治疗手段和疫苗开发中具有独特优势[30]；此外，对于RT-PCR核酸检测假阴性患者，利用测序技术可进一步确认，以有效提高检测结果的可靠性，并获得是否有其他病原体感染的信息，有助于鉴别诊断[23]。

1.2 抗体检测

据以往有关SARS-CoV的研究报道，患者血清IgM抗体在感染急性期出现(感染后7 d左右)，IgG抗体在感染中晚期出现，滴度有一个持续增高的过程，在血液循环中保持较长时间[31,32]。对SARS-CoV-2研究显示，COVID-19患者发病第8天IgM阳性率达100%，IgG出现相对较晚，发病两周之后阳性率达88.4%[33]。抗体检测能简单、快速、安全地实现对COVID-19患者血清、血浆和全血中的IgM和IgG体外检测。

SARS-CoV-2抗体检测方法主要包括胶体金免疫层析和ELISA方法。(1)胶体金免疫层析技术肉眼可直接观察到检测结果，相比较现有的核酸检测平台，对技术和人员要求均较低，加样后15 min即可观察到结果，实现对疑似患者进行现场检测与筛查，尤其适合于现场快速检测，但特异度、敏感度相对于核酸检测较弱[34,35]。(2)ELISA抗体检测适用于对疑似患者或者密切接触人群进行快速批量检测，以及抗体滴度测定。但此方法检测速度慢，步骤繁琐，限制了其在COVID-19暴发流行时的应用。

SARS-CoV-2抗体检测可与核酸检测实现互补。徐万洲等[36]对205例COVID-19确诊患者和79例非COVID-19人群进行血清SARS-CoV-2抗体检测的研究发现，血清IgM和IgG对COVID-19诊断的敏感度分别为70.24%(144/205)和96.10%(197/205)，临床特异度分别为96.20%(76/79)和92.41%(73/79)；与核酸检测相比，抗体检测具有较低的阳性预测值(95.63%比100%)，但具有较高的阴性预测值(91.03%比80.61%)；研究亦发现抗体检测能将94.74%(18/19)的核酸假阴性的COVID-19患者确诊。因此，对于核酸检测假阴性的患者，病毒核酸检测联合血清抗体检测有助于提高检测的准确性。

SARS-CoV-2抗体检测在疫情防控中具有重要意义。IgG出现较晚，但可在康复患者中持续存在，因此可用以回顾性分析特定人群的COVID-19的流行病学情况。IgG亦是病毒重要的特异性保护性抗体，其滴度高低与康复患者抗病毒能力相关，高滴度人群可从事病毒防疫工作或者贡献康复期血浆[37]。同时需注意，抗体检测易受血液标本中一些干扰物质(如类风湿因子、非特异IgM、溶血所致的高浓度血红蛋白等)的影响而出现假阳性结果。此外，在抗体产生的窗口期可出现假阴性的结果。

2 新技术在病毒核酸检测中的应用

近年来，各种新技术用于病毒核酸检测，如巢式PCR、纳米孔测序、基因芯片技术、恒温逆转录、荧光纳米探针等，提高检测效率，简化检测步骤。微流控技术被称为芯片上实验室，是将包括上述检测技术在内的多种技术灵活组合和规模集成在微小而可控的平台上，最大限度把实验室的功能转移到便携的、方寸大小芯片上，具有高通量、即时性、集成化、自动化、低成本便于携带的特点，1 h内即可完成现场检测[38]。有助于在疫情暴发期进行批量、快速和现场检测，促进SARS-CoV-2感染患者的快速筛选、确诊和分流，避免集中检测造成的医疗资源严重透支。

微流控检测技术有望实现SARS-CoV-2核酸快速扩增检测和病毒的鉴别诊断。将核酸快速提取、恒温逆转录扩增、便携式实时荧光检测和比色检测3个关键技术，整合于微流控芯片系统，一套系统可实现多人份样本平行检测(近3 000人份/d)，极大提高检测效率[39]。呼吸道病原体超20种，传统的PCR技术仅能对样本病原体进行逐一扩增，微流控芯片内部集成的高通量恒温核酸扩增模块分析系统具有大规模并行式微反应元件，可一次对同一样本进行多病毒检测[40]。目前，相应的微流控检测统已成功研发，能够在1 h内鉴定出多种病原体，包括季节性流感病毒、禽流感、合胞病毒、SARS-CoV、MERS-CoV和SARS-CoV-2，但其检测的准确性和稳定性仍需进一步评估。

空气传播是COVID-19最主要的传播途径，对空气病毒载荷检测有助于疫情防控。目前传统的空气微生物检测技术(落板培养法和安德森采样器法)敏感度较低且花费时间长，无法满足实时快速的应急处置需求。Jiang等[41]和Jing等[42]利用微流控技术将空气中病原体的捕获、富集、检测、鉴定整合在同一检测系统，实现3 h内对公共场所空气中多种病原体的检测。显然基于同样原理，包括COVID-19在内呼吸道多种病毒的高通量、全自动实时监测的分析系统的研发将有助于重点公共区域空气卫生防疫工作的有效实施。

3 小结与展望

SARS-CoV-2作为一种新型高传染性病毒，实验室检测能力能否满足疫情需求成为极大的挑战，病毒核酸检测广泛应用，操作相对复杂，需在P2级实验室进行；抗体检测操作简单易于推广，可与核酸检测实现互补，提高诊断阳性率，但不利于早期诊断。高通量、高自动化、高集成的技术开发和应用对此次和未来疫情防控意义重大。相对于传统检测技术，将SARS-CoV-2核酸检测方法与微流控技术结合，有望实现病毒的快速高通量诊断与鉴别诊断，值得推广。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突

参考文献略